PROSEDUR
1. Persiapan sampel
Ekstraksi DNA dari sampel klinis dilakukan sesuai dengan persyaratan dan prosedur yang sesuai dalam kit ekstraksi DNA virus.yang diekstraksi
DNA dapat langsung digunakan untuk deteksi.Jika sampel tidak terdeteksi segera setelah ekstraksi, sampel harus disimpan pada suhu -70 °C untuk standby, menghindari siklus beku-cair berulang.
2. Persiapan sistem reaksi
(1) Persiapan sistem: Keluarkan reagen dari kit, dan biarkan mencair sepenuhnya pada suhu kamar.Balikkan campuran dan sentrifus segera.Reaksi uji N (N = jumlah sampel yang akan diuji + kontrol positif + kontrol negatif + 1) masing-masing disiapkan untuk sistem reaksi, sebagai berikut.
| Komponen |
Volume untuk 1 sistem reaksi |
Volume untuk sistem reaksi N |
| Buffer reaksi PCR |
14μL |
14μLx N |
| Campuran Enzim PCR |
1L |
1μLx N |
| Jumlah volume |
15μL |
15μLx N |
(2) Distribusi sistem reaksi: Campur rata buffer reaksi di atas, sentrifus, dan keluarkan 15μL alikuot ke dalam tabung PCR yang cocok untuk instrumen PCR fluoresen.(Sentrifugasi tabung PCR pada 6.000rpm selama 30 detik dan pindahkan ke zona perlakuan sampel.)
3. Pemuatan sampel (Zona perlakuan sampel)
Tambahkan 10μL sampel asam nukleat, kontrol negatif dan kontrol positif masing-masing ke tabung PCR di atas.Tutup tabung dengan rapat dan sentrifus pada 6.000 rpm selama 10 detik dan kemudian pindahkan ke zona amplifikasi PCR.
* Perhatian: Menambahkan sampel dalam urutan berikut adalah:
direkomendasikan: kontrol negatif-> sampel asam nukleat -> kontrol positif.
4. Amplifikasi PCR (zona amplifikasi PCR)
4.1 Masukkan tabung PCR tertutup ke dalam mesin PCR waktu nyata untuk amplifikasi.
4.2 Pengaturan kondisi siklus PCR Fluoresensi
| Program |
Suhu |
Durasi reaksi |
Jumlah siklus |
|
1
|
50 °C |
2 menit |
1 |
| 2 |
95 °C |
2 detik |
1 |
| 3 |
95 °C |
1 detik |
41 |
| 60 °C |
13s/20s/35s |
Kumpulkan sinyal fluoresen pada langkah 3:60℃;35 detik untuk ABI 7500, 20 detik untuk SLAN-96S/96P, sedangkan 13 detik untuk Sistem PCR Real-Time lainnya.Volume total: 25μL.
4.3 Pembuangan setelah deteksi
Buang tabung PCR dalam kantong tertutup setelah reaksi dan perlakukan tabung bekas sebagai limbah medis.
5. Pengaturan untuk analisis hasil
Tetapkan garis dasar di wilayah sebelum amplifikasi eksponensial di mana sinyal fluoresen dari semua sampel relatif stabil (tidak ada fluktuasi yang signifikan di semua sampel);atur titik awal (nomor siklus) jauh dari fluktuasi sinyal di awal
fase pengumpulan fluoresensi;atur titik akhir (nomor siklus)1~3 siklus sebelum Ct sampel pertama untuk memasuki amplifikasi eksponensial.4~15 siklus direkomendasikan.
Atur ambang batas tepat di atas titik tertinggi dari kurva amplifikasi kontrol negatif (kurva noise tidak beraturan).
6. Kriteria kontrol kualitas
Sebelum mengevaluasi hasil spesimen, Kontrol Positif dan Kontrol Negatif harus diinterpretasikan menggunakan tabel interpretasi di bawah ini, dan kurva Kontrol Positif dan Kontrol Negatif harus dilakukan dengan benar, jika tidak, hasil sampel tidak valid.
Saluran/
Kontrol |
Nilai ambang siklus (Ct) |
| FAM |
VIC |
| Kontrol positif |
Kt > 40 atau UNDET |
Kt > 40 atau UNDET |
| Kontrol negatif |
Kt 35 |
Kt 35 |
7. Interpretasi Hasil Tes
Saluran FAM untuk Virus Monkeypox, hasil deteksi harus ditafsirkan seperti di bawah ini.
a) Positif: Ct 38 dan kurva amplifikasi berbentuk S.
b) Diduga: 38 < Ct 40 dan kurva amplifikasi berbentuk S, diperlukan pengujian kedua.Anggap positif jika Ct 40 dan kurva amplifikasi berbentuk S untuk pengujian kedua.Dianggap negatif jika Ct > 40 atau nol Ct dan Ct 35 di saluran VIC untuk pengujian kedua.
c) Negatif: Ct > 40 atau null Ct dan Ct 35 di saluran VIC.
d) Uji ulang: Ct > 40 atau null Ct dan Ct > 35 di saluran VIC.
Pesan Anda harus antara 20-3.000 karakter!
